都正學(xué)院 | “蛋白置換法”結(jié)合ICP-MS檢測(cè)尿液中銀離子濃度
發(fā)布時(shí)間：
2020-08-07
來源：
摘要：
通過“蛋白置換法”，可以分步實(shí)現(xiàn)尿液中銀離子的解聚和解吸附，有效解決銀離子非特異性吸附和嚴(yán)重殘留的難題，提高生物基質(zhì)中金屬離子的提取效率，改善ICP-MS在金屬離子藥物中的藥代動(dòng)力學(xué)檢測(cè)應(yīng)用。
前處理是檢測(cè)金屬離子的關(guān)鍵
銀離子藥物的殺菌機(jī)理，是通過游離的Ag+結(jié)合細(xì)胞等微生物中蛋白質(zhì)的自由疏基（可逆結(jié)合），改變蛋白表面電荷，使蛋白質(zhì)變性而凝固，破壞細(xì)胞合成酶活性，細(xì)胞因喪失分裂增殖能力而死亡。
大部分銀離子藥物的使用濃度趨近于痕量（低至μg/ml或ng/ml），無疑對(duì)銀離子濃度的檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確性提出了挑戰(zhàn)。電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS）是檢測(cè)銀離子等金屬離子的首選，常應(yīng)用于土壤、化妝品、水體、農(nóng)作物、食品等基體干擾較低的基質(zhì)中，如何有效的排除或降低尿液、血漿等生物基質(zhì)中的銀離子檢測(cè)干擾，是開發(fā)相關(guān)檢測(cè)方法必須解決的問題。
以尿液這類水溶液基質(zhì)來說，它含有大量水分，少量無機(jī)鹽、尿素、尿酸等，以及含量很低的蛋白質(zhì)和葡萄糖。在堿性尿液中，帶正電荷的銀離子極易吸附在表面帶負(fù)電荷的容器上（如玻璃、聚丙烯或聚苯乙烯），普通超聲處理和微波消解難以有效解除吸附。此外，由于膽汁排泄是消除銀的主要方式，而不是經(jīng)腎排泄，如需從尿液中檢測(cè)到銀，需要前處理方法非常高效的富集極低濃度銀離子。
當(dāng)前的消解法等前處理方法主要局限在于：
①處理方法簡(jiǎn)單，多采用硝酸一步直接稀釋，或增加固相萃取，但是銀離子極易吸附在管壁或者萃取柱上，解吸附效果差；
②解吸附的銀離子在富集過程中，易再次發(fā)生吸附而損失，次而產(chǎn)生殘留效應(yīng)，難以適用于銀離子藥物的定量研究。因此，開發(fā)一種改進(jìn)的生物基質(zhì)中銀離子富集方法具有現(xiàn)實(shí)意義。
“蛋白置換法”前處理方法原理
基于上述的尿液中銀離子富集難題，都正生物分析測(cè)試中心技術(shù)團(tuán)隊(duì)開發(fā)了“蛋白置換法”前處理方法，利用蛋白-銀離子螯合物的聚合能力強(qiáng)于銀離子與管壁的非特異性吸附能力，同時(shí)，該螯合物又可以通過pH的改變實(shí)現(xiàn)聚合和解聚，實(shí)現(xiàn)對(duì)生物基質(zhì)中銀離子進(jìn)行高效富集，相關(guān)原理見下圖。實(shí)施過程包括：
1）尿液樣本與少量稀硝酸經(jīng)一定比例混合，改變尿液的pH值為弱堿性或中性，解吸附容器管壁上的大部分銀離子；
2）加入一定量蛋白溶液，利用蛋白與銀離子等金屬物質(zhì)在弱堿性或中性環(huán)境下的吸附作用力，遠(yuǎn)大于容器管壁與銀離子吸附作用力的特征，1個(gè)蛋白分子可結(jié)合n個(gè)銀離子，置換結(jié)合容器管壁上、部分游離在溶液中的銀離子，形成蛋白-銀離子螯合物；
3）加入適當(dāng)倍率的稀硝酸，改變尿液的pH為酸性，解聚蛋白-銀離子螯合物，形成類似硝酸銀之類的易溶解型硝酸鹽，解離后的蛋白還可依靠空間位阻來阻斷銀離子與管壁的再吸附，獲得全部游離型銀離子；
4）采用適當(dāng)分離技術(shù)，將存在于倍率稀硝酸體系的游離型銀離子轉(zhuǎn)移到低吸附容器中，進(jìn)樣檢測(cè)。
▲ “蛋白置換法”原理
方法準(zhǔn)確度和精密度驗(yàn)證
對(duì)5種濃度質(zhì)控品通過2天連續(xù)3批前處理，結(jié)合ICP-MS驗(yàn)證本方法檢測(cè)尿液中銀離子濃度的準(zhǔn)確度（回收率）和精密度（重復(fù)性）。結(jié)果表明：5個(gè)不同濃度銀質(zhì)控品，各重復(fù)測(cè)定6次的準(zhǔn)確度偏差不超過標(biāo)示值的-2.61%~5.23%，均符合±15%之內(nèi)的接受標(biāo)準(zhǔn)；各濃度下的銀質(zhì)控品，6次測(cè)量結(jié)果批內(nèi)、批間精密度CV%在0.76%~1.93%，均符合≤15%的接受標(biāo)準(zhǔn)，驗(yàn)證了本方法的準(zhǔn)確度和精密度符合PK定量要求。
小結(jié)
都正生物分析測(cè)試中心利用銀離子在pH為弱堿性或中性時(shí)與蛋白的結(jié)合力更強(qiáng)于與容器管壁的結(jié)合力，蛋白-銀離子等金屬螯合物在堿性下結(jié)合、在酸性條件下完全解離的原理，摸索出“蛋白置換法”，有效解決了尿液中銀離子測(cè)不準(zhǔn)，難重復(fù)的問題，方法驗(yàn)證合格。
目前，相關(guān)方法已形成技術(shù)專利且應(yīng)用到實(shí)際樣本PK定量研究，同時(shí)結(jié)合臨床試驗(yàn)聯(lián)盟、自主開發(fā)的LIMS信息化系統(tǒng)和嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臄?shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)團(tuán)隊(duì)等自身優(yōu)勢(shì)資源，更好的服務(wù)于臨床評(píng)價(jià)，歡迎咨詢合作。
參考文獻(xiàn)
[1] Lin YS, Rothen ML, Milgrom P.Pharmacokinetics of 38% topical silver diamine fluoride in healthy adult volunteers [J].J Am Dent Assoc，2019,150(3):186-192
[2] 長(zhǎng)沙都正生物科技有限責(zé)任公司，一種生物基質(zhì)中銀離子富集方法、定量試劑盒及檢測(cè)方法[P],2020105001519
作者：侯利平
服務(wù)熱線：
中國(guó)長(zhǎng)沙：0731-85681666
網(wǎng)站建設(shè)：中企動(dòng)力 長(zhǎng)沙 seo標(biāo)簽 本網(wǎng)站已支持IPV6